緩沖鹽使用不當對色譜柱的影響及解決辦法!

柱壓升高
原因：緩沖鹽使用不當導致緩沖鹽析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙，阻礙流動(dòng)相傳質(zhì)，引起柱壓升高；

相同化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化
原因：如果沒(méi)有沖洗干凈就進(jìn)行進(jìn)樣，色譜柱內含有的鹽會(huì )使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化；

 

柱效下降

原因：

i)有些緩沖鹽會(huì )滲入到鍵合相的深處，損害硅膠基體，導致色譜柱鍵合相流失，柱床變松，柱效下降;

ii)凝結在鍵合相表面，使C18碳鏈難以舒展，對物質(zhì)的保留能力下降，導致柱效下降。因此用過(guò)緩沖鹽后需要對色譜柱進(jìn)行沖洗，水中緩沖鹽濃度較大時(shí)應特別引起注意。
 

流動(dòng)相中緩沖鹽的正確使用方法

1. 使用前的處理: 在使用緩沖鹽作流動(dòng)相之前需要用不含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗色譜柱，直至基線(xiàn)平穩。 原則上，用于沖洗的流動(dòng)相與分析時(shí)所用的流動(dòng)相含水的比例相同(或含水更多)，不同的只是用于沖洗用的流動(dòng)相中不含緩沖鹽。 理由：緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機溶劑。用含緩沖鹽的(特別是做流動(dòng)相的水為飽和的緩沖鹽溶液時(shí))流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí)，如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動(dòng)相中含水的比例相對較小，不先沖洗掉，接下來(lái)做樣品的時(shí)候所用的流動(dòng)相中如果有機溶劑含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時(shí)，緩沖鹽將會(huì )在色譜柱柱體上析出，沉積下來(lái)，這將可能導致上述對色譜柱的損害。

2. 使用后的處理：用與分析時(shí)含水比例相同的流動(dòng)相(與分析用流動(dòng)相唯*的區別是，用于沖洗的流動(dòng)相不含緩沖鹽)進(jìn)行沖洗約30min，直至基線(xiàn)平穩。如果該色譜柱在接下來(lái)很長(cháng)的一段時(shí)間內不使用，要長(cháng)期保存，則需再加上一步，即用純的有機溶劑沖洗一遍，直至基線(xiàn)平穩。

使用緩沖液要注意幾點(diǎn)：

1、避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對鋼質(zhì)有腐蝕作用。

2、緩沖液要現配現用，往往緩沖液是良好的菌類(lèi)培養液，隔天或放置長(cháng)時(shí)間實(shí)驗時(shí)會(huì )有很多怪現象發(fā)生。
3、實(shí)驗后不可用有機溶劑直接過(guò)度，有機溶劑會(huì )處使鹽類(lèi)析出，造成液路或色譜柱堵塞，可用95：5的水甲醇沖洗。

4、使用緩沖液要及時(shí)掌握ph范圍，做到胸中有數。

5、清洗液路和柱子時(shí)，有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗。

6、長(cháng)時(shí)間用緩沖溶液要注意觀(guān)察接頭處有無(wú)析出，若有白色鹽類(lèi)析出，可考慮一定周期用10%硝酸沖洗一下液路(拆下柱子，走30ml,再用5倍水沖洗)可以避免液路的堵塞。

7、選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類(lèi)造成不必要的麻煩。

如果流動(dòng)相中有機溶劑的比例很高是不能用來(lái)沖洗緩沖鹽的，是洗不出來(lái)的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇沖洗，是可以把緩沖鹽沖洗出來(lái)的，然后用純的有機溶劑來(lái)保護柱子。的方法是使用與流動(dòng)相相同濃度不含鹽的流動(dòng)相進(jìn)行清洗。但就是速度慢一些。用水是為了快速替換，一般在15分鐘以?xún)?，且?.8的流速較好. 如果用純水沖，容易造成鍵合的碳鏈的流失，用5%~10%甲醇水溶液沖。 可以用純水代替流動(dòng)相中的緩沖液，有機相不變。這樣沖洗柱子比較穩妥。

色譜柱異常及解決辦法

柱壓與硅膠基質(zhì)的形態(tài)(如無(wú)定形或球形硅膠)、顆粒大小、填料合成條件、裝柱條件、所用流動(dòng)相和分析時(shí)的溫度有關(guān)。不同廠(chǎng)家的色譜柱柱壓會(huì )有所差別，相同流動(dòng)相和溫度的條件下，不同廠(chǎng)家的新色譜柱有的柱壓可能相差4、5個(gè)MPa，特別是低端和色譜柱之間，這一區別比較明顯。這是由色譜柱廠(chǎng)家所選用的硅膠基質(zhì)及其生產(chǎn)條件決定的，這種差異的存在是正常的。同時(shí)需要說(shuō)明的一點(diǎn)是，柱壓與柱效有一定的關(guān)系，通常柱效高的色譜柱柱壓相對而言會(huì )高一點(diǎn)，但柱壓高的色譜柱并不一定就具有高柱效。

在色譜柱的使用過(guò)程中柱壓通常會(huì )出現兩種升高的形式：

種是，隨著(zhù)使用時(shí)間的延長(cháng)色譜柱柱壓慢慢上升，這是正常的；

第二種是，使用過(guò)程中(流動(dòng)相和溫度沒(méi)有改變的條件下)色譜柱壓力突然升高很多。這種壓力突然升高的現象，通常是由工作人員操作不當引起的。

原因：

1)樣品太臟，使用前沒(méi)有過(guò)濾，導致柱篩板堵塞；

2)樣品含有的雜質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性不是很好，與流動(dòng)相混合后析出，導致柱塞板堵塞； 

3)使用緩沖鹽，處理錯誤，緩沖鹽在色譜柱中析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙。

解決辦法對于第二種，即柱壓突然升高的情況，通常有以下幾種解決辦法：

1)將色譜柱反接，用含水比例較大的流動(dòng)相進(jìn)行沖洗。

2)色譜柱進(jìn)樣一端的篩板取下，分別放在水中和甲醇中超聲或更換新的柱篩板。如果柱效沒(méi)變，但柱壓仍然較高，則應考慮進(jìn)樣端填料受污染的問(wèn)題，因此除了取下進(jìn)樣端篩板超聲外，還需要挖掉進(jìn)樣端的部分填料，挖去填料之前先檢查一下填料的顏色，如果填料的顏色發(fā)生了變化，則應該挖掉直到見(jiàn)到白色的填料為止。

挖掉后色譜柱將出現一個(gè)缺口，填補缺口的填料可以從另一支相同品牌、相同型號的報廢色譜柱的出口端獲得，填料用有機溶劑如甲醇等調成糊狀裝入缺口處，壓緊刮平，再裝上篩板。

柱子使用經(jīng)驗談

色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測試，并將結果保存起來(lái)，作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時(shí)是按照色譜柱出廠(chǎng)報告中的條件進(jìn)行(出廠(chǎng)測試所使用的條件是*條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。

1、樣品的前處理：

a、使用流動(dòng)相溶解樣品。

b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。 

c、使用0.45µm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。

2、流動(dòng)相的配制：

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

a、流動(dòng)相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì )沉淀在柱中(或長(cháng)時(shí)間保留在柱中)。

b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(特殊情況除外)。

c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(cháng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(cháng)液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實(shí)驗無(wú)法進(jìn)行。

f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3、流動(dòng)相流速的選擇：

因柱效是柱中流動(dòng)相線(xiàn)性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。 當選用*流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(cháng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

a.由于甲醇廉價(jià)，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。 

b.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類(lèi)雜質(zhì)，有可能影響分析結果。

c.含水流動(dòng)相*在實(shí)驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。加入疊dan化na，防止細菌生長(cháng)。

d.流動(dòng)相要求使用0.45 µm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。

e.使用HPLC級溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(cháng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

沖柱子的目的
只要是有機溶劑就行，不過(guò)黏度不要太大，因為有機溶劑能夠防止細菌生長(cháng)，沖柱子的目的就是為了防止細菌生長(cháng)堵塞儀器系統和柱子。 一般甲醇和乙腈相互沖洗是沒(méi)有問(wèn)題的，但乙腈要比甲醇價(jià)格貴的 。


保留時(shí)間變化的原因:

柱頭塌陷

在使用過(guò)程中，填料下沉，在柱子進(jìn)口處出現一個(gè)小空間，使得分離效果不良。

補救方法：卸開(kāi)柱頭螺絲，找一點(diǎn)同類(lèi)填料，用甲醇濕潤后，添在柱子上，反復幾次。然后裝上螺絲，用溶劑沖洗1-2小時(shí)，使之平衡。

小結
正確使用緩沖鹽很有必要，既可以防止緩沖鹽析出，也可以達到提高色譜柱使用壽命的目的。我們不妨用一句話(huà)來(lái)總結它的使用方法：用前要過(guò)濾，用后需沖洗。